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RASSEGNE

L’albumina glicata nella gestione clinica del diabete mellito

Mosca A, Dozio E
L’albumina glicata si forma per reazione non enzimatica post-traduzionale tra l’albumina e il glucosio, e la sua misura riflette la glicemia media delle ultime 2-3 settimane antecedenti il prelievo. L’albumina glicata, a differenza dell’emoglobina glicata, può essere misurata sul siero o plasma anche in pazienti con anemie o emoglobinopatie, o con insufficienza renale, in alternativa all’emoglobina glicata, che non è utilizzabile in queste particolari situazioni. A parte il suo utilizzo in alternativa a quello dell’emoglobina A1c, l’albumina glicata è di per sé una proteina con un potere aterogenico importante per lo sviluppo delle complicanze macrovascolari e quindi la sua misura può avere un ruolo predittivo per queste condizioni. In questa rassegna rivediamo gli aspetti siopatologici di base, il suo possibile utilizzo in ambito diabetologico e i principali fattori pre-analitici e analitici.

Introduzione

L’albumina glicata (AG) è da poco entrata tra i parametri di laboratorio utili per la gestione del diabete mellito. Le principali linee guida, sia di laboratorio che cliniche, non ne parlano per nulla o ne fanno solo una menzione marginale, in attesa che studi clinici più rilevanti possano testimoniarne il valore e fornire i valori soglia utili per l’utilizzo in routine. Pertanto, scopo di questa rassegna è quello di prendere in esame tutti quegli aspetti che caratterizzano questo esame, mettendo in luce sia i punti di forza, che quelli che necessitano ancora di ulteriori conferme. Ci auspichiamo che questo contributo possa fare crescere l’interesse e alimentare nuovi studi che portino a maggiori solide evidenze.

Proprietà biochimiche e aspetti fisiopatologici dell’AG

Albumina: aspetti biochimici e fisiologici

L’albumina è la più abbondante proteina plasmatica. Rappresenta il 50-60% di tutte le proteine circolanti e in condizioni fisiologiche la sua concentrazione è compresa tra 3,5-5,5 g/dL. È una proteina globulare, di piccole dimensioni (66 kDa), costituita da una singola catena aminoacidica ricca di residui di lisina (59), arginina (24) e cisteina (35). Di questi ultimi, 34 sono impegnati nella formazione di 17 ponti disolfuro, importanti per la struttura terziaria della proteina. La cisteina 34 (Cys-34) è invece libera da legami e nella sua forma ridotta agisce da scavanger delle specie radicaliche e conferisce alla proteina importanti proprietà antiossidanti.

Da un punto di vista strutturale, la proteina è organizzata in tre domini (I, II, III) ciascuno contenente due sotto-domini, A e B. A livello del sottodominio IIA e IIB sono state identificate due regioni, chiamate rispettivamente Sudlow site I e II, che fungono da siti di legame per diversi substrati sia endogeni, che esogeni con affinità preferenziale, ma non esclusiva. Ad esempio, il sito I lega principalmente grandi composti eterociclici e sostanze endogene, tra cui la bilirubina e le porfirine. Il sito II, più piccolo, stereoscopico e meno flessibile, lega preferibilmente i composti aromatici, tra cui le benzodiazepine e l’ibuprofene.

Anche la regione N-terminale e la Cys-34 svolgono funzione di legame sia nei confronti di farmaci, che di diversi cationi metallici. La proteina contiene anche sette siti di legame per gli acidi grassi, regola l’equilibrio acido-base e il mantenimento della pressione oncotica.

Sia la riduzione dei livelli circolanti, che eventuali cambiamenti strutturali in grado di modificare alcune proprietà biochimiche e fisiche della proteina potrebbero quindi causare la perdita di alcune funzioni.

AG: modificazioni strutturali e implicazioni patologiche

La glicazione è una reazione tra uno zucchero riducente, come il glucosio e il fruttosio, o prodotti del loro metabolismo, e una proteina o un lipide senza l’azione catalitica di un enzima. La formazione di prodotti glicati è abbastanza complessa ma, secondo una visione più semplificata, è spesso descritta come un processo chimico che procede attraverso tre fasi: iniziale, intermedia e avanzata. Nella fase iniziale, l’interazione tra il carbonio carbonilico dello zucchero e un gruppo amminico disponibile in una proteina porta alla formazione di una aldimina intermedia (base di Schiff). La fase intermedia prevede la trasformazione chimica di questo prodotto di glicazione precoce in un ketoammina più stabile (prodotto di Amadori) e l’ultima fase è la formazione dei prodotti di glicazione avanzata (AGEs) irreversibili a seguito di ulteriori reazioni di ossidazione, degradazione e reazioni con altre proteine.

In realtà, la chimica del processo di glicazione è molto più complessa, come ben descritto in una rassegna di Cho focalizzata sul profilo meccanicistico dei percorsi di glicazione. Questo scenario suggerisce chiaramente non solo la complessità del processo di glicazione, ma anche la ridondanza di alcune fasi, la possibilità di generare gli stessi AGEs attraverso diversi percorsi chimici e la difficoltà di concepire una strategia univoca per la prevenzione e la gestione della formazione di tali prodotti coinvolti nello sviluppo di diverse complicanze del diabete mellito. Rispetto ad altre proteine, l’albumina è più sensibile al processo di glicazione per diverse ragioni: 1) l’elevata concentrazione; 2) la sua vita media di circa 21 giorni; 3) il gran numero di residui di lisina e arginina che possono essere coinvolti nella formazione di prodotti di glicazione. Sebbene siano presenti 59 residui di lisina, solo pochi di essi (525, 439, 199, 51, 378, 545, 12, 233, 276, 281, 317, 323 e anche il N-terminale) sono un reale bersaglio di glicazione. Probabilmente, l’accessibilità a questi siti e la pKa di ciascun gruppo amminico sono i fattori principali della suscettibilità di questi residui alla glicazione. AG può contenere sia prodotti di glicazione precoce che avanzati. Questi ultimi possono derivare sia dalla trasformazione di addotti precoci già presenti a livello della proteina, sia da nuove interazione tra la proteina e prodotti di glicazione precoci preformati.

Gli studi di laboratorio indicano che le modificazioni indotte dalla glicazione alterano in modo significativo la struttura dei due siti di legame Sudlow I e II e della Cys-34, suggerendo così una potenziale alterazione generale delle proprietà leganti dell’albumina, anche nei confronti di molteplici farmaci, e una riduzione del suo potere antiossidante e di scavenger. La glicazione sembra quindi causa di potenziali cambiamenti degli effetti terapeutici e/o tossici di tutti i farmaci che legano l’albumina, con una grande variazione principalmente per agenti che agiscono in una finestra terapeutica relativamente ristretta. Anche se fortemente sostenuto da studi in vitro, il significato clinico di questi risultati non è ancora ben chiaro. È comunque possibile che la ridotta capacità di legame nei confronti degli acidi grassi, soprattutto acido arachidonico, si associ a un maggior rischio trombotico nel soggetto diabetico.

Nella forma glicata, l’albumina non presenta semplicemente cambiamenti nelle sue funzioni fisiologiche, ma acquista anche un fenotipo patologico. I livelli elevati di AG possono indurre danni irreversibili nei diversi organi, che sono i principali bersagli delle complicanze del diabete mellito (come le arterie coronarie, il sistema cardiovascolare, il rene, l’occhio e il sistema nervoso). Ad esempio, nel rene, AG stimola le cellule epiteliali e del mesangio a produrre molecole pro-ossidanti e tessuto connettivo, contribuendo così all’insorgenza della nefropatia. Nel campo delle malattie cardiovascolari, AG svolge un ruolo nell’attivazione e nell’aggregazione delle piastrine, regola l’espressione delle molecole di adesione coinvolte nella formazione di placche aterosclerotiche, come ICAM-1 e VCAM-1, e promuove l’ossidazione. A livello metabolico AG, aumentando la produzione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno, riduce la secrezione di insulina e induce resistenza all’azione della stessa.

L’attivazione del recettore cellulare per gli AGEs (RAGE) è uno dei principali meccanismi attraverso cui AG esercita i suoi effetti dannosi. Infatti, l’attivazione di RAGE stimola la produzione di citochine pro-infiammatorie, induce apoptosi, stress ossidativo e aggregazione piastrinica, tutti eventi che sono stati associati all’aumento dei livelli AGEs e nello specifico di AG.

L’AG come biomarcatore in diverse condizioni cliniche

AG per lo screening e il monitoraggio del diabete mellito

AG è attualmente utilizzata nei paesi asiatici, tra cui il Giappone, per lo screening e il monitoraggio del diabete mellito e la stratificazione del rischio di complicanze associate alla malattia. Lo studio KOPS ha suggerito l’utilità di AG nella diagnosi del diabete mellito nella popolazione giapponese, utilizzando 15,5% come cut-off diagnostico (sensibilità 83,3%, specificità 83,3%). In uno studio osservazionale trasversale condotto su individui giapponesi con glucosio a digiuno compreso tra 5,5-6,9 mmoL/L, HbA1c < 6,5% e nei quali la diagnosi di diabete mellito è stata effettuata sulla base dei risultati del test OGTT, valori di AG > 15,2% sono risultati un utile strumento di screening della presenza di malattia. Nella Tabella I sono riportati alcuni tra i più significativi studi sull’argomento, principalmente condotti su popolazioni asiatiche, e i valori di riferimento AG per la diagnosi e il monitoraggio del diabete mellito. Si rimanda a una sezione successiva per la discussione degli intervalli di riferimento nella popolazione caucasica.

AG: marcatore glicemico a medio termine

Rispetto a HbA1c che è un indicatore glicemico a lungo termine (circa 120 giorni), AG è un indicatore glicemico a medio termine, poiché riflette la vita media dell’albumina (circa 20 giorni). Questo significa che, rispetto a HbA1c, AG può indicare precocemente sia un miglioramento, che un peggioramento del compenso glicemico di un paziente ed è quindi utile in tutte quelle condizioni che richiedono un controllo a breve termine dei cambiamenti della glicemia, ad esempio dopo l’inizio o la modifica di una terapia.

I soggetti in cui si manifesta un diabete mellito tipo 1 fulminante presentano un significativo innalzamento dei livelli di glucosio plasmatico in un tempo molto breve. In queste condizioni, AG aumenta maggiormente rispetto a HbA1c e il rapporto AG/HbA1c risulta superiore rispetto a quello osservato in soggetti con diabete mellito scompensato. Per discriminare le due condizioni patologiche è stato proposto un rapporto AG/HbA1c ≥ 3,2 (sensibilità 97%, specificità 98%). La ragione per cui i livelli di AG aumentano più velocemente rispetto a HbA1c dipendono molto dalla biochimica dell’albumina, dalla sua elevata velocità di glicazione e dalla sua emivita nel siero.

AG e glicemia post-prandiale

In termini di rischio cardiovascolare, la glicemia post-prandiale può essere un fattore di rischio più elevato rispetto ai livelli di glucosio a digiuno. È quindi importante un’attenta valutazione di tale parametro, al fine di ottimizzare i livelli di glucosio post-prandiali e ridurre il rischio associato. Nei pazienti con diabete mellito, principalmente tipo 1, il glucosio post-prandiale può oscillare all’interno di un ampio intervallo di valori. Essendo l’albumina un substrato facilmente glicabile, AG risulta essere un valido indicatore delle fluttuazioni glicemiche post-prandiali. Ciò permette di identificare alterazioni non facilmente apprezzabili, né con il monitoraggio puntiforme della glicemia, a meno dell’utilizzo di un monitoraggio in continuo, né con la HbA1c perché poco sensibile a picchi glicemici repentini e di breve durata. Pertanto, questo rinforza l’utilità di AG come biomarcatore complementare a HbA1c.

L’iperglicemia marcata è anche spesso riscontrata nei pazienti gastrettomizzati. Il loro rapporto AG/HbA1c è di solito superiore rispetto ai valori riscontrati in soggetti sani, suggerendo che AG, aumentando maggiormente rispetto a HbA1c, risulta un miglior indicatore delle escursioni glicemiche in questi individui.

AG: biomarcatore di complicanze del diabete mellito

Il rischio di sviluppare complicanze associate alla malattia è indubbiamente un argomento di grande interesse, ma può essere realmente stimato, solo se si hanno a disposizione dei biomarcatori validi a tal fine. A oggi sono stati condotti molteplici studi che hanno portato all’elaborazione di diversi algoritmi, alla ricerca della miglior combinazione di parametri con il più elevato valore predittivo. Come discusso in precedenza, se AG ben riflette le oscillazioni glicemiche post-prandiali e tali valori sono un importante fattore di rischio per le complicanze associate al diabete mellito, soprattutto cardiovascolari, allora anche AG va tenuta in considerazione come predittore del rischio. Inoltre, è importante ricordare che AG può svolgere per sé un ruolo patogenico, promuovendo l’infiammazione, la disfunzione endoteliale, lo sviluppo di placche ateromasiche e la fibrosi renale.

Lo studio ARIC ha messo in evidenza come i livelli di AG siano strettamente correlati con l’incidenza di diabete mellito e le sue complicanze micro vascolari, con un valore prognostico paragonabile a quello di HbA1c.

In una sub-popolazione dello studio DCCT/EDIC, sia AG che HbA1c sono risultate associate in maniera simile alla presenza di nefropatia e retinopatia e tali associazioni sono state rafforzate combinando le due misure. Solo HbA1c è invece risultata associata al rischio di malattie cardiovascolari. AG, in maniera simile a HbA1c, è stata ulteriormente associata allo spessore dell’intima media, un indicatore di aterosclerosi subclinica, suggerendo quindi la sua utilità per la stima del rischio aterosclerotico.

Questi dati suggeriscono che AG può essere quindi un ulteriore aiuto non solo per il monitoraggio e lo screening del diabete mellito, ma anche per la stratificazione del rischio associato alla malattia. Anche se ulteriori studi sono necessari per chiarire il ruolo prognostico di AG, indubbiamente quello che emerge dagli studi ad oggi disponibili è che AG non vuole sostituire HbA1c, ma che la combinazione dei due parametri possa rappresentare uno strumento interessante per la stratificazione del rischio.

Aspetti pre-analitici e analitici

Per quanto riguarda gli aspetti pre-analitici in vivo, AG è scarsamente influenzata dalla carenza di ferro, mentre negli individui con carenza di ferro i livelli di HbA1c sono superiori rispetto ai livelli medi di glucosio plasmatico. Ciò dipende principalmente dal rallentamento della sintesi di emoglobina e dell’eritropoiesi. Di conseguenza, la vita media degli eritrociti circolanti aumenta, l’emoglobina esistente diventa più vecchia, più facilmente glicabile e quindi si osserva un aumento della percentuale di HbA1c.

Una condizione fisiologica in cui HbA1c soffre di alcuni limiti come indicatore del controllo glicemico è la gravidanza. Durante la gravidanza HbA1c subisce un cambiamento bifasico: diminuisce dal primo al secondo trimestre, a causa della diminuzione dei livelli di glucosio plasmatico, e risale dal secondo al terzo trimestre, a causa della carenza di ferro. A differenza di HbA1c, AG non solo non è influenzata dalla carenza di ferro ma, essendo un marcatore glicemico a medio termine (questo sarà discusso in dettaglio nella prossima sezione), garantisce un controllo più serrato del compenso glicemico in gravidanza, fondamentale per ridurre il rischio di complicanze sia fetali che materne. Tuttavia va detto che gli intervalli di riferimento per l’AG in gravidanza definiti dai precedenti studi andrebbero rivisti su popolazione di etnia caucasica, con una maggiore attenzione all’arruolamento perché, a nostro avviso, la selezione dei soggetti inclusi negli studi degli autori giapponesi soffriva di diversi punti deboli.

AG è anche un utile biomarcatore per il monitoraggio del diabete mellito nei neonati nei quali HbA1c sembra non riflettere correttamente lo stato glicemico a causa degli alti livelli di emoglobina fetale.

Anche il controllo glicemico nel paziente nefropatico e nel dializzato sembra essere meglio gestibile con AG. Infatti, la ridotta sintesi di eritropoietina, la sua eventuale supplementazione e la distruzione meccanica degli eritrociti nei soggetti sottoposti a emodialisi possono alterare la vita media eritrocitaria e quindi la capacità di HbA1c di riflettere in maniera efficiente la glicemia media.

Per quanto riguarda la parte pre-analitica in vitro, i campioni possono essere plasma in EDTA o litio eparina, e siero. I campioni congelati a -70°C hanno una stabilità di oltre 10 anni, a -20°C non oltre 6 mesi e quelli a +4°C sono stabili una settimana. A temperatura ambiente il campione è stabile 24 ore.

Per quanto riguarda infine la parte analitica, l’AG può essere misurata con cromatografia di affinità, a scambio ionico, liquida ad alta prestazione (HPLC) e immunodosaggi (ELISA o radioimmunodosaggi). Recentemente è stato automatizzato un metodo enzimatico che presenta buone performance analitiche (QuantiLab Glycated Albumin, Instrumentation Laboratory – A Werfen Company, Milano). Il metodo è basato sull’iniziale eliminazione di aminoacidi endogeni glicati e perossidi grazie a una chetoamina ossidasi e a una preossidasi. L’AG viene poi idrolizzata da una proteinasi albumina-specifica e i prodotti di questa reazione sono ossidati da una chetoamina ossidasi. Il perossido d’idrogeno prodotto viene poi misurato quantitativamente, grazie al classico metodo colorimetrico di Trinder. In parallelo viene misurata con il metodo del viola di bromocresolo la concentrazione di albumina, in modo da permettere di esprimere il risultato finale come rapporto tra AG e albumina totale. Questo metodo può essere implementato nelle principali piattaforme analitiche automatizzate e offre buone prestazioni analitiche. In particolare, nel corso di una recente valutazione multicentrica condotta in Italia, il metodo implementato sulle principali piattaforme analitiche di grande automazione mostrava una ripetibilità compresa tra lo 0,9 e l’1,2%, con un CV intra-laboratorio compreso tra l’1,2 e l’1,6%, con un ottimo allineamento tra i diversi centri (r compreso tra 0,996 e 0,998).

Intervalli di riferimento

Due studi recenti che hanno valutato gli intervalli di normalità di AG in soggetti di razza caucasica hanno evidenziato i risultati che sono mostrati in Tabella I. Indubbiamente, la differenza di età nei due gruppi di studio (17-95 anni vs 18-65 anni, rispettivamente) potrebbe spiegare le differenze osservate nei livelli di AG, poiché è risaputo che l’invecchiamento si associa a un aumento fisiologico dei livelli dei prodotti di glicazione e quindi anche a un aumento di AG.

Il secondo studio, fatto in modalità multicentrica su soggetti donatori di sangue in buone condizioni di salute, è sicuramente più robusto e importante anche per la numerosità campionaria (oltre 1300 soggetti), e può essere preso come riferimento per soggetti adulti sani. Sono state riscontrate minime differenze significative tra i generi, ed è stato invece trovato un significativo aumento dell’AG in funzione dell’età dei soggetti, con maggiori incrementi nei soggetti di sesso maschile. Secondo tale studio, il limite superiore di AG nei soggetti sani era 14,5%. I soggetti con valori maggiore a tale limite avevano un’età media di 48 ± 12 anni, il 66,7% di essi era di genere maschile e la loro glicemia media era pari a 125 ± 45 mg/dL.

Limitazioni per l’utilizzo dell’AG

Come discusso nelle sezioni precedenti, in alcune specifiche condizioni cliniche AG offre notevoli vantaggi per il monitoraggio dello stato glicemico rispetto ai biomarcatori attualmente disponibili e utilizzati in ambito clinico. In alcune specifiche condizioni patologiche, soprattutto quelle caratterizzate da variazioni del metabolismo dell’albumina, i livelli di AG non riflettono però in maniera ottimale i livelli plasmatici di glucosio. La Tabella II riassume le principali indicazioni e i limiti dell’utilizzo dell’AG nell’ambito clinico.

Ad esempio, condizioni caratterizzate da un aumentato metabolismo dell’albumina, come la sindrome nefrosica e l’ipertiroidismo, i livelli di AG risultano inferiori rispetto ai livelli di glucosio plasmatico.

Anche nell’obesità, i livelli di AG sarebbero inferiori alla glicemia media probabilmente a causa del maggiore catabolismo dell’albumina indotto dallo stato di microinfiammazione cronica tipica del soggetto obeso. A supporto di ciò è stato evidenziato come i livelli di AG sono correlati negativamente proprio con il tessuto adiposo viscerale, un importante fattore di rischio cardio-metabolico in grado di promuovere uno stato di flogosi cronica. Sebbene non si conoscono ancora con certezza i reali meccanismi responsabili di tale associazione, l’effetto dell’obesità viscerale sui livelli di AG deve essere tenuta in considerazione nell’utilizzo clinico di AG.

Una simile alterazione è stata riscontrata anche in altre condizioni caratterizzate da infiammazione cronica quali nei fumatori, nei pazienti con malattia epatica non alcolica, nell’ipertrigliceridemia e iperuricemia.

In tutte le condizioni in cui il metabolismo dell’albumina è invece ridotto, come la cirrosi epatica e l’ipotiroidismo, i livelli di AG sono superiori rispetto alla glicemia media. Nelle malattie epatiche croniche (CLD), sia AG che HbA1c hanno alcuni limiti per il monitoraggio dello stato glicemico. AG risulta più elevata a causa della ridotta sintesi dell’albumina mentre HbA1c è inferiore a causa dell’ipersplenismo e del conseguente aumentato catabolismo degli eritrociti. Partendo dal presupposto che i livelli misurati di HbA1c sono circa un terzo dei valori di AG (HbA1c = AG/3), si è osservato come il parametro CLD-HbA1c, ricavato dalla media tra la misura di HbA1c e il suo valore stimato con AG/3, sia un migliore indicatore del controllo glicemico nei pazienti con CLD 53. Tale parametro infatti ben correla con il valore di HbA1c calcolato sulla base della formula di conversione stabilita da Rohlfing.

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